Trafikolyckan inträffade i norra delarna av Färjestaden klockan 15.50 på onsdagseftermiddagen. Vad som orsakade olyckan är oklart.
– Vi kommer att hålla förhör med alla inblandade för att utreda vad som har hänt, säger Åsa Emanuelsson på polisens pressavdelning.
De fyra cyklisterna fördes till sjukhus med ambulans, men en pojkes liv gick inte att rädda. En kvinna i 45-årsåldern omkom också i olyckan. Anhöriga har underrättats.
En man i 50-årsåldern och en pojke, under 15 år, vårdas på akuten med lindriga skador.
Ingen av dem var hemmahörande i Kalmar län.
Söker vittnen
Personbilen är bärgad från platsen och kommer tillsammans med de fyra cyklarna att genomgå en teknisk undersökning.
– Vi söker också efter vittnen som kan ha sett vad som hände, säger Åsa Emanuelsson.
Polisen har hållit förhör med föraren till personbilen. Händelsen rubricerades inledningsvis som grovt drograttfylleri, grov vårdslöshet i trafik, grovt vållande till annans död i två fall och vållande till kroppsskada.
Misstankarna om drograttfylleri släpptes senare efter att blodprover inte visade spår av droger hos mannen.