Rycket kom med 3,7 kilometer kvar och Eklöf lyckades hålla undan och var först över mållinjen på den vackra platån Prato Piazza, 2 000 meter över havet.
– Det är väldigt imponerande. Det är hans livs lopp, säger Anders Blomquist.
Tvåa blev Stian Hoelgaard, 7,6 sekunder bakom Johannes Eklöf. Tord Asle Gjerdalen knep sista pallplatsen (+10,5).
– Det är galet, man åker bara och är livrädd att någon ska åka i kapp sista kilometerna. Men tydligen var det ett ganska bra ställe att rycka på, säger Eklöf till SVT Sport.
– Segern betyder jättemycket. Målet för säsongen var att få gå upp på pallen en gång, efter det är det bara att ha kul.
26-åringen gjorde ett liknande ryck i går, då lyckades dock klungan bakom komma tillbaka. Max Novak, som då vann, blev näst bästa svensk i dag med sin femteplats.
Topp 10 i Prato Piazza Mountain Challenge
1. Johannes Eklöf 1,40,35
2. Stian Hoelgaard +7,6
3. Tord Asle Gjerdalen +10,5
4. Alexey Shemiakin +14,2
5. Max Novak +19,4
6. Martin Johnsrud Sundby +1,02,4
7. Oskar Kardin +1,02,8
8. Herman Paus +1,49,7
9. Magnus Vesterheim +2,07,3
10. Emil Persson +2,49,8