Vinnaren i matchen på fredag går vidare till nästa omgång med de 16 bästa.
– Det är så tidigt i turneringen men det är som det är. Det är inte hela världen. Vi skulle hellre ha mötts senare. Vi kommer båda att komma ut som vanligt och spela vårt bästa inför er, säger Serena Williams efter sin match på onsdagskvällen lokal tid.
Sexfaldiga mästarinnan Serena vann över Witthoeft med 6–2, 6–2 i matchen som bara varade i en timme och sju minuter på onsdagskvällen.
– Det är alltid så bra publik på kvällen. Det är helt fantastiskt att spela inför den här publiken, säger en nöjd Serena Williams efter segern.
Systern Venus, som vann US Open år 2000 och 2001, vann sin senaste match över italienska Camila Giorgi med 6–4, 7–5.
Systrarna har inte mötts så tidigt i en grand slam-turnering sedan Australian Open 1998. Senast de möttes, i en turnering i Indian Wells tidigare i år, vann Serena över Venus.
Senast systrarna möttes i en grand slam-turnering var 2017 då Serena vann i raka set.