Orlandos borgmästare Buddy Dyer tackade dem som först hjälpt till efter attacken och sade att överlevande och offrens familjer kommer att ha stadens framtida stöd.
– Vi kommer inte att definieras av en hatfylld handling av en galen mördare, sade han.
50.000 uppskattas ha deltagit i ljusmässan vid Lake Eola. Människor bar regnbågsflaggor, amerikanska flaggor och höll i ljus och vita blommor. Bland annat deltog Floridas guvernör Rick Scott.
Tidigare hölls en minnesgudstjänst i en närliggande kyrka, där även begravningar av offren har hållits under helgen.